Faserphotometriesystem für Forschungszwecke FLiP

NeurowissenschaftenGlasfaserFluoreszenz

Übersicht
Das RWD Fluorescence Lifetime Photometry System (FLiP) kombiniert Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) mit Faserphotometrie zur Echtzeitüberwachung von Fluoreszenzlebensdauer-Änderungen im Gehirn frei bewegter Tiere. FLiP ermöglicht stabile, quantitative in vivo-Messungen von Neurotransmitter-Dynamiken, Protein–Protein-Interaktionen und konformationellen Änderungen, indem es die Fluoreszenzlebensdauer (τ) berichtet — einen intrinsischen Parameter, der weitgehend unabhängig von Sondenexpression, Photobleaching und Bewegungsartefakten ist.

Warum Fluoreszenzlebensdauer?

• Die Lebensdauer ist unabhängig von Fluorophorkonzentration und Anregungsleistung und reflektiert das lokale Mikroenvironment und konformationelle Veränderungen.
• Ermöglicht quantitative, zwischen Proben vergleichbare Messwerte ohne Baseline-Normalisierung.
• Geeignet für stabile Langzeitaufzeichnungen in Schlafstudien, Modellen chronischer Erkrankungen und Längsschnittuntersuchungen.
• Ermöglicht empfindliche Detektion dynamischer Analytänderungen mittels lebensdauerbasierter Biosensoren.

Zwei gebräuchliche Messmethoden

• Time-Domain (TCSPC): Regt die Probe mit gepulster Lichtemission an und zeichnet den zeitlichen Fluoreszenzabfall auf. TCSPC zeitstempelt einzelne Photonen, baut Zerfallshistogramme auf und extrahiert Lebensdauern mittels exponentieller Anpassung. Bietet hohe zeitliche Auflösung und überlegene SNR bei geringem Photonenfluss; kann mehrere Lebensdauerkomponenten mit hoher Präzision auflösen.
• Frequency-Domain: Regt mit sinusförmig moduliertem Dauerlicht an und leitet die Lebensdauer aus Phasenverzögerung und Modulationstiefe ab. Einfachere Implementierung und schnelle Erfassung, geeignet für Proben mit hohem Photonenfluss oder Systeme ohne gepulste Laser.

Vergleich (Time-Domain vs Frequency-Domain)

• Genauigkeit der Lebensdauer-Messung — Time-Domain (TCSPC): hoch; Frequency-Domain: gut
• SNR bei schwach fluoreszierenden Proben — Time-Domain (TCSPC): ausgezeichnet; Frequency-Domain: relativ begrenzt
• Auflösung mehrerer Lebensdauerkomponenten — Time-Domain (TCSPC): hohe Präzision; Frequency-Domain: erfordert Mehrfrequenzmodulation oder Phasor-Analyse
• Erfassungsgeschwindigkeit — Time-Domain (TCSPC): relativ schnell; Frequency-Domain: schnell
• Proben mit hohem Photonenfluss — Time-Domain (TCSPC): gut; Frequency-Domain: ausgezeichnet
• Laseranforderung — Time-Domain (TCSPC): gepulster Laser; Frequency-Domain: modulierte Dauerlichtquelle

Hauptmerkmale des FLiP-Systems

• Systemstabilität ausgelegt zur Minimierung von Gerätezustands-Schwankungen für zuverlässige longitudinale Vergleiche.
• Niedriges Systemrauschen zur Erhaltung der Signalqualität bei schwacher Fluoreszenz.
• Fähigkeit zu Langzeitaufzeichnungen mit minimiertem Baseline-Drift über aufeinanderfolgende Wochen.
• Kompatibilität mit einer breiten Palette von Fluoreszenzlebensdauer-Biosensoren.
• Direkte quantitative Analyse: geplante Standardkurvenfunktion zur Umrechnung von Lebensdauerwerten in Konzentrationsabschätzungen.

Anwendungsbeispiele

• Neuromodulator-Messungen über Tiere und chronische Zeiträume: Lebensdauerwerte (z. B. GRAB ACh3.0) bleiben trotz Laserleistungs- und Expressionsvariabilität stabil und können Verhaltenszustände unterscheiden.
• Mechanistische Studien zu psychiatrischen Risikogenen: FLiP eingesetzt, um abnorme striatale PKA-Dynamik in Akap11-Mutanten-Mäusen bei frei bewegten Aufnahmen zu zeigen.
• Entwicklung und Validierung neuer Lifespan-Sensoren: z. B. LifeCamp Calcium-Lebensdauersensor, der absolute Messung transitorischer und basaler Calcium-Signale über Zelltypen und Verhaltensweisen ermöglicht.

Technische Merkmale / Spezifikationen

• Allgemeine System-Spezifikationen
  • Anregungswellenlängen (Optionen): 488, 515, 560, 640, 670 nm (anpassbar)
  • Impulsfrequenz: 1–80 MHz
  • Messbereich der Lebensdauer: 1–10 ns
  • Abtastrate: 1–50 Hz
  • DIO-Anzahl: 8
  • Spannungspegel: 3.3–5 V
  • Kerndurchmesser der Glasfaser: 200 oder 400 µm
  • Numerische Apertur (NA): 0.37
• Kompatibilität mit Lebensdauer-Biosensoren (Beispiele mit Anregungswellenlängen)
  • Ca2+: Tq–Ca–FLITS — Anregung ~439 nm; tr-CCaMP — ~437 nm; tr-GCaMP — ~493 nm; tr-RCaMP — ~563 nm; RCaMP1h — ~560 nm; LifeCaMP — ~488 nm
  • ACh (Acetylcholin): GRAB ACh3.0 — 488 nm; GRAB FLIM-ACh Varianten — 515 nm; GRAB WHalo-ACh-1.0 (farbstoffbasiert) — 565 nm / 680 nm (JF-Farbstoffe)
  • DA (Dopamin): dLight3.8 — 488 nm; GRAB FLIM-DA1.0 — 515 nm
  • PKA: tAKARα, tAKARβ, tAKARγ — 488 nm; FLIM-AKAR — 488 nm; GRAB FLIM-PKA — 515 nm
  • PKC: CKAR3 — 488 nm
  • Extrazelluläres Glutamat: Rncp-iGluSnFR1 — 560 nm
  • Serotonin (5-HT): sDarken — 488 nm
  • Norepinephrin (NE): GRAB FLIM-NE1h / GRAB FLIM-NE1m — 515 nm; GRAB rNE3.0 — 560 nm; GRAB TMP-NE1.0 (farbstoffbasiert) — ~690 nm; GRAB WHalo-NE — 565 nm / 680 nm (JF-Farbstoffe)
  • 5-HT (Alternative): GRAB FLIM-5-HT0.3 — 515 nm
  • CRF: GRAB rCRF1.0 — 570 nm
  • PACAP: GRAB rPACAP1.0 — 570 nm
  • Glukose: iGlucoSnFR-TS — 400 nm
  • Laktat: LiLac — 425 nm
  • ATP: qMaLioffG — 488 nm