Testkit für Forschungszwecke CFTK-HMM-0076

für die medizinische ForschungKoagulationTMB

Produktname
ELISA-Kit für humanen aktivierten Gerinnungsfaktor VIIa (FVIIa) (Katalog-Nr.: CFTK-HMM-0076)

Anwendung
In-vitro-Quantifizierung des humanen aktivierten Gerinnungsfaktors VIIa (FVIIa) in Serum, Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturüberständen und verwandten biologischen Flüssigkeiten.

Nachweisprinzip
Der Kit basiert auf einem Doppelantikörper-Ein-Schritt-Sandwich-ELISA. Proben, Standards und HRP-markiertes Nachweisantikörper werden in vorbeschichtete Mikroplatten mit FVIIa-Fangantikörper gegeben, inkubiert und gewaschen. Die Farbentwicklung erfolgt mit TMB, das durch HRP katalysiert blau wird und durch Säure gelb gestoppt wird. Die Farbintensität ist proportional zur FVIIa-Konzentration; die Absorption wird bei 450 nm gemessen und zur Konzentrationsberechnung verwendet.

Probenaufbereitung

• Serum: Blut in Serumtrennröhrchen sammeln; 2 Std. bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C gerinnen lassen, bei 1000×g 20 Min. zentrifugieren und Überstand entnehmen; bei Bedarf bei -20°C oder -80°C lagern. Mehrmaliges Einfrieren/Auftauen vermeiden.
• Plasma: Mit EDTA oder Heparin sammeln, innerhalb von 30 Min. nach Entnahme bei 2–8°C bei 1000×g 15 Min. zentrifugieren, Überstand entnehmen; bei -20°C oder -80°C lagern. Mehrmaliges Einfrieren/Auftauen vermeiden.
• Gewebehomogenat: Gewebe mit gekühltem PBS (0,01 M, pH 7,4) spülen, wiegen und zerkleinern, PBS hinzufügen (typ. 1:9 g/v), ggf. Proteaseinhibitoren zugeben, auf Eis homogenisieren, ggf. sonizieren oder Gefrier‑Auftau‑Zyklen durchführen, bei 5000×g 5–10 Min. zentrifugieren und Überstand entnehmen.
• Zellkulturüberstand/andere: Überstand bei 1000×g 20 Min. zentrifugieren und Überstand für die Messung verwenden oder bei -20°C/-80°C lagern. Hämolysierte Proben ungeeignet.

Benötigte Reagenzien / Instrumente / Verbrauchsmaterialien

• Mikroplattenleser (450 nm)
• Präzisionspipetten und Spitzen: 0,5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL
• Inkubator 37°C oder Thermostat
• Destilliertes oder deionisiertes Wasser

Standardkonzentrationen

• 16 ng/mL
• 8 ng/mL
• 4 ng/mL
• 2 ng/mL
• 1 ng/mL
• 0,5 ng/mL

Reagenzvorbereitung
Bringen Sie die Kitreagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Verdünnen Sie 20× Waschpuffer 1:20 mit destilliertem Wasser (1 Teil 20× Waschpuffer + 19 Teile Wasser).

Verfahren (Zusammenfassung)

• 1. Platte 20 Min. auf Raumtemperatur ausgleichen; benötigte Vertiefungen verwenden und restliche Platten verschließen und bei 4°C lagern.
• 2. 50 µL Standards in die Standardvertiefungen geben.
• 3. 50 µL Probe in die Probenvertiefungen geben (nicht in Leervertiefungen).
• 4. 100 µL HRP-markiertes Nachweisantikörper in jede Standard- und Probenvertiefung (außer Leervertiefung) geben, verschließen und 60 Min. bei 37°C inkubieren.
• 5. Flüssigkeit verwerfen und jede Vertiefung mit 350 µL Waschlösung waschen, 1 Min. stehen lassen; Waschschritt 5x wiederholen (oder Plattenwaschgerät verwenden).
• 6. 50 µL Substrat A und 50 µL Substrat B in jede Vertiefung geben, 15 Min. bei 37°C inkubieren.
• 7. 50 µL Stopp-Lösung in jede Vertiefung geben und OD bei 450 nm innerhalb von 15 Min. messen.

Berechnung der Ergebnisse
Tragen Sie die OD‑Werte der Standards gegen deren Konzentration auf, erstellen Sie die Standardkurve, ermitteln Sie die Regressionsgleichung und berechnen Sie die Probenkonzentration durch Einsetzen der Proben‑OD in die Gleichung.

Leistung

• Nachweisbereich: 0,5–16 ng/mL
• Sensitivität: < 0,1 ng/mL
• Spezifität: Keine Kreuzreaktivität mit verwandten löslichen Analoga
• Wiederholbarkeit: Intra‑Assay CV < 10 %; Inter‑Assay CV < 15 %

Hinweise / Wichtige Hinweise

• 1. Proben, die die maximale Standardkonzentration überschreiten, vor Teststart mit dem Probenpuffer verdünnen.
• 2. Genau die vorgegebenen Inkubationszeiten und Temperaturen einhalten; alle Reagenzien vor Gebrauch auf 20–25°C bringen und nach Gebrauch kühlen.
• 3. Unzureichendes Waschen oder Austrocknen der Vertiefungen kann zu falschen Ergebnissen führen; für ordnungsgemäßen Ablauf sorgen und Austrocknen während der Inkubation vermeiden.
• 4. Flüssigkeitsreste und Fingerabdrücke am Boden der Platte entfernen, um OD‑Interferenzen zu vermeiden.
• 5. Substratlösung muss farblos oder sehr blass sein; nicht verwenden, wenn sie blau geworden ist.
• 6. Kreuzkontamination von Reagenzien und Proben vermeiden.
• 7. Reagenzien und Reaktionen vor starker Lichtaussetzung schützen.
• 8. Verschlossene Beutel vor dem Öffnen auf Raumtemperatur bringen, um Kondenswasser zu vermeiden.
• 9. Reaktionsreagenzien nicht mit Bleichmitteln oder starken Lösungsmitteldämpfen in Kontakt bringen.
• 10. Keine abgelaufenen Produkte verwenden.
• 11. Proben mit möglichem Infektionsrisiko nach den geltenden Sicherheitsvorschriften handhaben.

Technische Spezifikationen

• Katalog-Nr.: CFTK-HMM-0076
• Testart: Human
• Haltbarkeit: 6 Monate
• Lagerung: 2–8°C
• Nachweisprinzip: Doppelantikörper‑Ein‑Schritt‑Sandwich‑ELISA; HRP/TMB‑Nachweis; OD‑Messung bei 450 nm
• Standardkurvenpunkte: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 ng/mL
• Nachweisbereich: 0,5–16 ng/mL
• Sensitivität: < 0,1 ng/mL
• Intra‑Assay CV: < 10 %; Inter‑Assay CV: < 15 %