Das Fe(II) aller Hämoglobinformen, mit Ausnahme von Sulfohämoglobin, wird durch Ferrocyanid zu Fe(III) zu Methämoglobin oxidiert, das wiederum mit ionisiertem Cyanid (CN-) unter Bildung von Cyanmethämoglobin reagiert, einem sehr stabilen Derivat, das bei 540 nm absorbiert. Die Intensität der gebildeten Farbe ist proportional zur Konzentration des gesamten Hämoglobins in der Probe.
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